Τελ. ενημέρωση:
01-Mar-2001

Αρχ Ελλ Ιατρ, 17(4), Ιούλιος-Αύγουστος 2000, 377-382

ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

Επίπεδα φλεγμονωδών κυτταροκινών σε ενήλικες ασθενείς
με κυστική ίνωση

Α. ΠΑΠΑΜΙΧΑΛΟΠΟΥΛΟΣ,¹ Σ. ΝΑΝΑΣ,² Ε. ΠΟΥΛΙΟΥ,¹
Γ. ΠΕΡΠΑΤΗ,¹ Ειρ. ΜΑΥΡΟΥ,² Ε. ΠΑΠΑ,³ Ι. ΟΙΚΟΝΟΜΙΔΟΥ,³
Κ. ΚΑΡΜΑΝΙΩΛΑΣ,¹ Χ. ΡΟΥΣΣΟΣ²

¹Ιατρείο Κυστικής Ίνωσης, Νοσοκομείο Νοσημάτων Θώρακος Αθηνών
²Μονάδα Νοσημάτων Θώρακος, Κλινική Εντατικής Θεραπείας, Ευγενίδειο Θεραπευτήριο, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Αθηνών
³Εργαστήριο Ανοσολογίας και Ιστοσυμβατότητας, ΓΠΝΑ "Ευαγγελισμός

H κυστική ίνωση (ΚΙ) είναι η πιο συχνή κληρονομική νόσος της λευκής φυλής. Το γονίδιο της κυστικής ίνωσης ανακαλύφθηκε το 1989 και ανευρίσκεται στο μακρό τμήμα του χρωματοσώματος 7.¹ Η πρωτεΐνη, που κωδικοποιείται από το γονίδιο, ονομάζεται CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) και αποτελεί δίαυλο ιόντων χλωρίου, του οποίου η λειτουργία είναι ιδιαίτερα πολύπλοκη και δεν έχει ακόμη πλήρως διερευνηθεί.² Η κύρια ανωμαλία συνίσταται σε διαταραχή της διαπερατότητας της κυτταρικής μεμβράνης στο χλώριο, με αποτέλεσμα την αφυδάτωση των εκκρίσεων, η οποία στο επίπεδο των αεραγωγών προκαλεί μείωση της βλεννοκροσσωτής κάθαρσης, λοιμώξεις και βρογχεκτασίες. Αν και η απόφραξη των αεραγωγών και η λοίμωξη αποτελούν μείζονες παθογενετικούς παράγοντες, σήμερα πιστεύεται ότι η φλεγμονή είναι ο πλέον σημαντικός.³ Τόσο η φλεγμονή όσο και η λοίμωξη ενέχονται στη μείωση των λειτουργικών παραμέτρων της αναπνοής, τη βαρύτητα και την εξελικτική πορεία της νόσου, που τελικά καθορίζουν την επιβίωση των ασθενών αυτών. Ο πρώιμος αποικισμός του βρογχικού δένδρου από μικροβιακούς παράγοντες, όπως ο χρυσίζων σταφυλόκοκκος, ο αιμόφιλος της ινφλουέντσας και η ψευδομονάδα, προκαλεί τη μαζική μετανάστευση ουδετεροφίλων και την απελευθέρωση διαφόρων φλεγμονωδών μεσολαβητών, με αποτέλεσμα την τοπική απορρύθμιση της ειδικής και μη εδικής ανοσίας, την αδυναμία εκρίζωσης των παθογόνων μικροοργανισμών και την εγκατάσταση ενός φαύλου κύκλου λοίμωξης-φλεγμονής-απόφραξης.³ Επειδή οι φλεγμονώδεις κυτταροκίνες (TNFα, IL-1β, IL-6, IL-8) παίζουν σημαντικό ρόλο στη φλεγμονώδη απόκριση,⁴ υποθέσαμε ότι πιθανώς να σχετίζονται με τη βαρύτητα της νόσου.

Σκοπός της εργασίας αυτής ήταν ο προσδιορισμός των επιπέδων των φλεγμονωδών κυτταροκινών (TNFα, IL-1β, IL-6, IL-8) στον ορό ενηλίκων ασθενών με ΚΙ και υγιών μαρτύρων, καθώς και η διερεύνηση της συσχέτισης των επιπέδων των φλεγμονωδών κυτταροκινών με τη βαρύτητα της νόσου, όπως αυτή εκτιμάται με τον FEV₁ και το Schwachman score.

ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΣ

Στη μελέτη αυτή περιελήφθησαν 19 ασθενείς με κυστική ίνωση (10 άνδρες/9 γυναίκες, ηλικίας 23±12 ετών), που παρακολουθούνταν στο Εξωτερικό Ιατρείο Κυστικής Ίνωσης του Νοσοκομείου Νοσημάτων Θώρακος Αθηνών, και 11 υγιείς μάρτυρες (3 άνδρες/8 γυναίκες, ηλικίας 30±4 ετών). Στον πίνακα 1 φαίνονται τα χαρακτηριστικά των δύο ομάδων. Όλοι οι ασθενείς, κατά το χρόνο της μελέτης, ήταν σε σταθερή κατάσταση. Ασθενείς με πρόσφατη παρόξυνση της νόσου αποκλείονταν από τη μελέτη. Η διάγνωση στηρίχθηκε στην κλινική εκτίμηση και τις εργαστηριακές εξετάσεις, συμπεριλαμβανομένων της δοκιμασίας ιδρώτα και του γονότυπου. Οι υγιείς μάρτυρες ήταν εθελοντές, χωρίς σημεία καρδιολογικού ή αναπνευστικού νοσήματος, σύμφωνα με το ιστορικό και την κλινική εξέταση.

Εκτίμηση της βαρύτητας της νόσου

Χρησιμοποιήθηκαν δείκτες, όπως ο FEV₁ (% προβλεπομένου)⁵ και το Schwachman score. Το Schwachman score αποτελεί το συνυπολογισμό τεσσάρων διαφορετικών παραμέτρων της νόσου: της καθημερινής δραστηριότητας, των κλινικών σημείων, της θρέψης και της ακτινολογικής εικόνας.⁶

Λειτουργικές δοκιμασίες

Σε όλους τους συμμετέχοντες στη μελέτη μετρήθηκαν οι FVC, FEV₁ και η διαχυτική ικανότητα (DLco) με τη μέθοδο της μίας αναπνοής.⁷

Κυτταροκίνες

Δείγματα αίματος ελήφθησαν από τους ασθενείς και τους υγιείς μάρτυρες για τον προσδιορισμό των επιπέδων των φλεγμονωδών κυτταροκινών (IL-1β, TNFα, IL-6, IL-8) στον ορό με τη μέθοδο ELISA και, συγκεκριμένα, με ποσοτική sandwich ανοσοενζυμική τεχνική. Για τον προσδιορισμό του επιπέδου κάθε κυτταροκίνης χρησιμοποιήθηκαν τα αντίστοιχα Quantakine Human Immunoassay Kits (R & D Systems). Η μέθοδος αυτή δεν παρουσιάζει καμία διασταυρούμενη αντίδραση με άλλες κυτταροκίνες ή αυξητικούς παράγοντες.

Τα δείγματα αίματος λαμβάνονταν σε αποστειρωμένο φιαλίδιο χωρίς αντιπηκτικό και διατηρούνταν στους 4 °C μέχρι να φυγοκεντρηθούν. Η φυγοκέντρηση γινόταν σε διάστημα μικρότερο των δύο ωρών από τη λήψη του αίματος σε ψυχόμενη φυγόκεντρο στις 3000 στροφές στους 4 °C για 10 min. Ο ορός φυλασσόταν σε αποστειρωμένο φιαλίδιο στους -70 °C μέχρι τη μέτρηση.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Τα επίπεδα των φλεγμονωδών κυτταροκινών TNFα, IL-6 και IL-8 (πίν. 2) στους ασθενείς με ΚΙ βρέθηκαν στατιστικώς σημαντικά υψηλότερα σε σχέση με εκείνα των υγιών μαρτύρων: TNFα: 4,0±1,8 (pg/mL) έναντι 1,7± 0,9 (pg/mL), P<0,006 (εικ. 1), IL-1β: 0,5±0,9 (pg/mL) έναντι 0,2±0,1 (pg/mL), P=ns, IL-6: 3,4±3,1 (pg/mL) έναντι 0,9±0,8 (pg/mL), P<0,003 (εικ. 2), IL-8: 5,5±4,7 (pg/mL) έναντι 2,6±0,5 (pg/mL), P<0,029 (εικ. 3), αντιστοίχως. Τα επίπεδα της IL-6 ήταν στατιστικώς σημαντικά αυξημένα στους ασθενείς που ήταν αποικισμένοι με ψευδομονάδα σε σχέση με τους μη αποικισμένους (4,9±3,3 έναντι 1,4±1,5, P<0,009). Οι υπόλοιπες κυτταροκίνες (TNFα, IL-1β, IL-8) δεν διέφεραν στους ασθενείς με και χωρίς αποικισμό με ψευδομονάδα (εικ. 4). Διπαραγοντική ανάλυση συσχετίσεων μεταξύ των δεικτών βαρύτητας της νόσου (FEV₁, Schwachman score) και των επιπέδων των φλεγμονωδών κυτταροκινών έδειξε ότι δεν υπάρχει στατιστικώς σημαντική σχέση.

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Η μελέτη αυτή έδειξε αυξημένα επίπεδα των φλεγμονωδών κυτταροκινών TNFα, IL-6 και IL-8 στον ορό των ασθενών με κυστική ίνωση. Τα αυξημένα επίπεδα των κυτταροκινών αυτών ήταν ανεξάρτητα της βαρύτητας της νόσου. Επίσης, τα επίπεδα του TNFα και της IL-8 ήταν ανεξάρτητα του αποικισμού των ασθενών με ψευδομονάδα, ενώ τα επίπεδα της IL-6 ήταν στατιστικώς σημαντικά υψηλότερα στους ασθενείς που ήταν αποικισμένοι με ψευδομονάδα σε σχέση με τους μη αποικισμένους.

Έχει διαπιστωθεί πρώιμη φλεγμονώδης απόκριση σε παιδιά, ακόμη και πριν από τον αποικισμό του βρογχικού δένδρου, με αυξημένα επίπεδα φλεγμονωδών κυτταροκινών στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα.⁸ Επίσης, σε ενήλικες ασθενείς χωρίς την κλινική παρουσία νόσου έχει διαπιστωθεί αυξημένη φλεγμονώδης απόκριση των αεραγωγών, όπως συνάγεται από την παρουσία φλεγμονωδών κυττάρων και ανοσοσφαιρινών στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα.⁹

Το ουδετερόφιλο θεωρείται το κύριο εκτελεστικό κύτταρο για τις βλάβες που προκαλούνται στον πνεύμονα. Ο έλεγχος της επιστράτευσης του κυττάρου αυτού από τον αγγειακό χώρο στο διάμεσο ιστό και τελικά στους αεραγωγούς βρίσκεται υπό τον έλεγχο των φλεγμονωδών κυτταροκινών.^4,10,11 Η φαγοκυττάρωση των βακτηριδίων από τα μακροφάγα προκαλεί τη σύνθεση και έκκριση TNFα και IL-1β. Ακολούθως, η έκκριση IL-6 και IL-8 διεγείρεται από τον TNFα και την IL-β, ενώ η IL-6 αναστέλλει την παραγωγή TNFα και IL-1β.¹²

H παραγωγή του TNFα από τα μακροφάγα παίζει σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση των ουδετεροφίλων και, σε συνεργασία με την IL-1β, στην παραγωγή και απελευθέρωση της IL-8 από τα τύπου ΙΙ επιθηλιακά κύτταρα του πνεύμονα και τους ινοβλάστες.¹³ Σε μια προοπτική μελέτη σε ενήλικες ασθενείς με ΚΙ διαπιστώθηκε χρονία αύξηση των επιπέδων του TNFα στον ορό, η οποία συνοδευόταν από παράλληλη αύξηση της CRP και του συμπλέγματος της ελαστάσης.¹⁴

Αυξημένα επίπεδα IL-8 έχουν ανιχνευθεί στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα, τα πτύελα και τον ορό παιδιών με ΚΙ. Τα επίπεδα της IL-8 στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα και τα πτύελα παρουσίασαν στατιστικώς σημαντική συσχέτιση με το Schwachman score, ενώ τα αντίστοιχα επίπεδα του ορού δεν εμφάνισαν παρόμοια συσχέτιση.¹⁵

Τα επίπεδα της IL-1β του ορού των ασθενών με ΚΙ δεν βρέθηκαν υψηλότερα σε σχέση με εκείνα των υγιών μαρτύρων. Αυξημένα επίπεδα IL-1β στον ορό έχουν βρεθεί σε μία εργασία,¹⁶ όμως, σε δύο πρόσφατες μελέτες, δεν κατέστη δυνατή η ανίχνευση της ανωτέρω κυτταροκίνης στον ορό.^17,18

Η ΙL-6 είναι ο σημαντικότερος επαγωγέας της απόκρισης οξείας φάσης σε συνδυασμό με την IL-1 και τον TNFα, ενώ τα κυψελιδικά μακροφάγα παράγουν μεγάλες ποσότητες IL-6 όταν εκτεθούν σε ενδοτοξίνες.¹⁹ Η IL-6 έχει δειχθεί ότι διεγείρει τον υποθαλαμο-υποφυσιο-επινεφριδιακό άξονα,²⁰ με συνακόλουθη έκκριση ACTH και αύξηση του επιπέδου των γλυκοκορτικοειδών,²¹ ελέγχοντας έτσι την εξέλιξη της φλεγμονής. Με αυτή την έννοια, η IL-6 είναι ταυτόχρονα φλεγμονώδης και αντιφλεγμονώδης κυτταροκίνη.²² Σε πρόσφατες μελέτες φαίνεται ότι η δράση της IL-6 είναι κυρίως αντιφλεγμονώδης και ανοσοκατασταλτική.²³ Σε πειραματικές μελέτες σε ποντίκια έχει δειχθεί ότι η χορήγηση IL-6 καταστέλλει την οξεία εξίδρωση ουδετεροφίλων, την οποία προκαλεί η ενδοτραχειακή έγχυση λιποπολυσακχαρίδης (ΛΠΣ).²⁴ Επίσης, η χορήγηση ΛΠΣ σε ποντίκια με ανεπάρκεια IL-6 προκάλεσε ανορεξία, απώλεια βάρους και υπογλυκαιμία, που σημαίνει ότι η IL-6 δεν είναι απαραίτητη για τη φλεγμονώδη απόκριση στη ΛΠΣ και, στην πραγματικότητα, ασκεί προστατευτική δράση.²⁵

Στη δική μας μελέτη, τα επίπεδα των φλεγμονωδών κυτταροκινών, εκτός της IL-6, ήταν ανεξάρτητα του αποικισμού των ασθενών με ψευδομονάδα. Σε πρόσφατη μελέτη διαπιστώθηκε ότι η εκρίζωση της ψευδομονάδας δεν ήταν ικανή να ανακόψει την εξελικτική πορεία της νόσου,²⁶ γεγονός που μπορεί να σημαίνει ότι η φλεγμονώδης απόκριση στην ΚΙ βαίνει ανεξάρτητα από τη λοίμωξη. Τα υψηλότερα επίπεδα της IL-6 στους ασθενείς που ήταν αποικισμένοι με ψευδομονάδα μπορεί μερικώς να εξηγηθούν από το γεγονός ότι οι φλεγμονώδεις κυτταροκίνες εμφανίζονται σε διαφορετικούς χρόνους, όπως έχει παρατηρηθεί μετά από πρόκληση με ΛΠΣ,²² και με διαφορετικό ρόλο, όπως αντιφλεγμονώδη και ανοσοκατασταλτικό,^23,24 που πιθανώς να είναι πλέον εξεσημασμένος μετά τον αποικισμό με ψευδομονάδα.

Συμπερασματικά, τα αυξημένα επίπεδα των φλεγμονωδών κυτταροκινών (TNFα, IL-6, IL-8) είναι ενδεικτικά της παρουσίας της φλεγμονής σε κάθε φάση στην εξελικτική πορεία της νόσου. Περαιτέρω μελέτες απαιτούνται για τη διευκρίνιση της σχέσης φλεγμονής-λοίμωξης, καθώς και του ρόλου των κυτταροκινών στην ΚΙ. Η διευκρίνιση του ρόλου των κυτταροκινών έχει μεγάλη σημασία για τη θεραπευτική προσέγγιση της νόσου, με τη χρήση ανταγωνιστών των κυτταροκινών, που ήδη χρησιμοποιούνται στη θεραπευτική άλλων νοσημάτων.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

1. COLLINS FS. Cystic fibrosis: Molecular biology and therapeutic implications. Science 1992, 159:37–48
2. WELSH M, ANDERSON M, RICH DP. Cystic fibrosis, CFTR and abnormal electrolyte transport. In: Davis PB (ed) Cystic Fibrosis. Marcel Dekker, New York, 1993:64–72
3. KONSTAN MW, BERGER M. Infection and inflammation of the lung in cystic fibrosis. In: Davis PB (ed) Cystic Fibrosis. Marcel Dekker, New York, 1993:219–275
4. STRIETER RM, LUKACS NW, STANDIFORD TJ, KUNKEL SL. Cytokines and lung inflammation: mechanisms of neutrophil recruitment to the lung. Thorax 1993, 48:765–769
5. SWACHMAN H, KULCZYCKI L. Long-term study of one hundred five patients with cystic fibrosis. Am J Dis Child 1958, 96:6–15
6. AMERICAN THORACIC SOCIETY. Single breath carbon monoxide diffusing capacity. Recommendations for a standard technique. Am Rev Respir Dis 1987, 136:1299–1307
7. BALOUGH K, McCUBBIN M, WEINBERGER M, SMITS W, AHRENS R, FICK R. The relationship between infection and inflammation in the early stages of lung disease from cystic fibrosis. Pediatr Pulmonol 1995, 20:63–67
8. KONSTAN MW, HILLIARD KA, NORVELL TM, BERGER M. Bronchoalveolar lavage findings in cystic fibrosis patients with stable, clinically mild lung disease suggest ongoing infection and inflammation. Am J Respir Crit Care Med 1994, 150:448–454
9. SHALE DJ. Cytokines in cystic fibrosis. In: Dodge JA, Brock DJH, Widdicombe (eds) Cystic Fibrosis–Current Topics. John Wiley & Sons, 1994, 2:278–301
10. HEATH AW. Cytokines and infection. Curr Opin Immunol 1990, 2:380–384
11. VAN DEUREN M, DOFFERHOFF ASM, VAN DER MEER JWM. Cytokines and the response to infection. Am J Pathol 1992, 168:349–356
12. KUNKEL SL, STANDIFORD T, STRIETER RM. Interleukin-8: the major neutrophil chemotactic factor in the lung. Exp Lung Res 1991, 17:17–23
13. NORMAN D, ELBORN JS, CORDON SM, RAYNER RJ, WISEMAN MS, HILLER EJ. Plasma tumor necrosis factor alpha in cystic fibrosis. Thorax 1991, 46:91–95
14. DEAN TP, DAI Y, SHUTE JK, CHURCH MK, WARNER JO. Interleukin-8 concentrations are elevated in bronchoalveolar lavage, sputum and sera of children with cystic fibrosis. Pediatr Res 1993, 34:159–161
15. ZITNIK RJ, ELIAS JA. Interleukin-6 and the lung. In: Kelley J (ed) Cytokines of the Lung. Marcel Dekker, 1992, 61:229–280
16. LYSON K, McCANN SM. The effect of interleukin-6 on pituitary hormone release in vivo and in vitro. Neuroendocrinology 1991, 54: 262–266
17. HEINRICH PC, CASTELL VJ, ANDUS T. Interleukin-6 and the acute phase response. Biochem J 1990, 265:621–636
18. WILDER RL. Interleukin-6 in autoimmune and inflammatory disease. In: Papanicolaou DA (moderator). The pathophysiologic roles of interleukin-6 in human disease. Ann Intern Med 1998, 128:127–137
19. TILG H, DINARELLO CA, MIER JW. IL-6 and APPs: anti-inflammatory and immunosuppressive mediators. Immunol Today 1997, 18: 428–432
20. ULICH TR, YIN S, GUO K, YI ES, REMICK D, DEL CASTILLO J. Intratracheal injection of endotoxin and cytokines. II. Interleukin-6 and transforming growth factor beta inhibit inflammation. Am J Pathol 1991, 138:1071–1079
21. FATTORI E, CAPPELLETTI M, COSTA P, SELLI HOC, CANTONI L, CARELLI M. Defective inflammatory response in interleukin-6 deficient mice. J Exp Med 1994, 180:1243–1250
22. SHARMA GD, TOSI MF, STERN RC, DAVIS PB. Progression of pulmonary disease after disappearance of Pseudomonas in cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med 1998, 152:169–173
23. PERLSTEIN RS, WHITNALL MH, ABRAMS JS, MONGEY EH, NETA R. Synergistic role of interleukin-6, interleukin-1, and tumor necrosis factor in the adrenocorticotropin response in vivo. Endocrinology 1993, 132:946–952
24. ENGELHARDT JF, YANKASKAS JR, EMST SA, YANG Y, MARINO CR, BOUCHER RC. Submucosal glands are the predominant site of CFTR expression in the human bronchus. Nat Genet 1992, 2:240–247
25. JACQUOT J, PUCHELLE E, HINNRASKY J, FUCHEY C, BETTINGER C, SPILMONT C. Localization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in airway secretory glands. Eur Respir J 1993, 6:169–176
26. ENGELHARDT JF, ZEPEDA M, COHN JA, YANKASKAS JR, WILSON JM. Expression of the cystic fibrosis gene in adult human lung. J Clin Invest 1994, 93:737–749